در این بخش به این موضوع می پردازیم که مولکول های پرانرژی چگونه برای تولید ترکیبات قندی یا کربوهیدرات ها مورد استفادة گیاه قرار می گیرند.
الف- چرخة کلوین: در سالهای بین 1946 تا 1953 سه تن از دانشمندان به نامهای ملوین کلوین، جیمز بشام و آندروبنسون راه متابولیکی تبدیل گازکربنیک به قند را در گیاهان کشف کردند. آنها این کار را از طریق پیگیری از بین رفتن گازکربنیک رادیواکتیو نشان دار در کشت های سلول های جلبک انجام داده اند. آزمایشهای اولیة کلوین نشان داد جلبک هایی که به مدتی که دقیقه و یا بیشتر در معرض گازکربنیک نشان دار قرار گرفته بودند، ترکیب پیچیده ای از متابولیت های نشان دار، شامل قندها و اسیدهای آمینه تولید کردند. با وجود این ، تجزیة جلبکی که 5 ثانیه در معرض گازکربنیک نشان دار قرار گفته بود نشان داد که اولین ترکیب پایدار رادیواکتیو فعال که در جلبک تشکیل گردید 3- فسفوگلیسرات یا PG3 بوده است که در ابتدا فقط از طرف گروه کربوکسیل (-COOH) نشان دار شده است. این نتایج بلافاصله این پیشنهاد را مطرح می سازد که PG3 توسط کربوکسیلاسیون یک ترکیب دوکربنه به دست آمده است. چنین مادة پیش ساختی تاکنون کشف نشده است. چنانچه واکنش کربوکسیلاسیونی واقعاً اتفاق بیفتد فقط روی یک قند 5 کربنه به نام ریبولوز –5- فسفات یا RU5P انجام می گیرد.
در نتیجة کربوکسیلاسیون قتند 5 کربنة ریبولوز –5- فسفات، یک قند 6 کربنه به دست می آید که به دو ترکیب سه کربنه تجزیه می گردد و هر کدام از این ترکیبات سه کربنه به یک ملکول PG3 تبدیل می گردند. راه کلی این تغییر و تبدیل را که در شکل شمارة 219 نشان داده شده است، چرخة کلوین و یا جرخة احسایی پنتوز فسفات می نامند. این راه شامل کربوکسیلاسیونیک پنتوز، تشکیل ترکیبات قندی و بازیافت ریبولوز –5- فسفات یا Ru5P می باشد.
در جریان جستجوی یافتن کربوکسیلاسیون مادة مور اثر، ترکیبات حد واسط نشان دار فراوان دیگری کشف گردیدند. به عنوان مثال در مراحل اولیة راه، فقط کربن های شماره 3 و 4 در قند 6 کربنة فروکتوز –1، 6- بیس فسفات یا FBP نشان دار هستند، ولی در مراحل بعدی تعداد کمتری از کربن های این قند نشان دار شده و شمارة این کربن ها کمتر از ترکیبات قند در مراحل اولیة راه است . مشاهدة جریان حرکت کربن نشان دار در انواع مختلف قندهای سه، پنج، شش و هفت کربنه ساختمان اصلی راه متابولیکی پیشندی کلوین را مشخص می کند که به طور کامل در شکل شمارة 219 آمده است. واقعیت بسیاری از واکنش هایی که قبلاً به صورت پیش بینی بیان شده بود در مطالعات بعدی آزمایشگاهی با استفاده از آنزیم های مختلف به تأیید رسیده است.
مرحلة اول- مرحلة تولید (قسمت بالایی شکل شمارة219) که در آن سه مولکول ریبولوز –5- فسفات یا Ru5p با سه مولکول گازکربنیک برای تولید 6 مولکول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP وارد واکنش می شوند. در این واکنش های بیوشیمیایی 9 مولکول ATP و 6 مولکول NADPH مورد استفاده قرار می گیرد. طبیعت چرخه ای این راه متابولیکی باعث می شود که این فرایند بتواند به ازای هر سه مولکول گازکربنیک مصرفی، معادل یک ملکول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP تولید نماید. در این نقطه از راه متابولیکی یک مولکول GAP می تواند از چرخه خارج شده و در راههای دیگر متابولیکی مورد استفاده سلول قرار گیرد.
مرحلة دوم: مرحلة بازیافت ( قسمت پایینی شکل شمارة 219) که در آن اتم های کربن 5 مولکول گلیسرآلدئید –3- فسفات یا GAP باقیمانده ، شبه راه پنتوز فسفات، دریک سری از واکنش های بیوشیمیایی شرکت می کند تا اینکه در نهایت برای شروع مجدد چرخة، سه مولکول ریبولوز –5- فسفات تولید نمایند. این مرحله را می توان به چهار سری واکنش به صورت زیر تقسیم کرد. شماره واکنش ها با شمارة آنها در شکل شمارة219 مطابقت دارد:
به طور کلی می توان چرخة کلوین را در معادلة سادة ذیل خلاصه کرد:
باید به این نکته توجه کرد که مرحلة‌دوم چرخة کلوین بدون استفاده از مولکول های پرانرژی ATP و NADPH انجام می گیرد.
اولین واکنش چرخة کلوین فسفوریلاسیون ریبولوز –5- فسفات یا RU5P به کمک آنزیم فسفوریبولوکیناز است که در این واکنش ریبولوز-5، 5- بیس فسفات یا RuBP تولید می گردد. بعد از کربوکسیلاسیون، مولکول RuBP مولکول 3- فسفوگلیسرات به دست آمده ابتدا به مولکول 1،3- بیس فسفوگلیسرات یا BPG تبدیل شده و سپس به GAP تبدیل می شود.
مرحلة دوم چرخة کلوین با واکنش ایزومریزاسیون مولکول گلیسرآلدئید –3- فسفات به دی هیدروکسی استون فسفات یا DHAP توسط آنزیم تریوز فسفات ایزومراز آغاز می شود که این واکنش برعکس واکنش معروف شمارة 5، راه گلیکولیز است. بعد از این واکنش، دی هیدروکسی استون فسفات می تواند در مسیر دو راه یکسان وارد واکنش های بیوشیمیایی بعدی شود: واکنش ها شمارة 6 تا 8 و یا واکنش های شمارة 9 تا 11، واکنش های شمارة 6 و 9 از چرخة کلوین، واکنش های تراکم عامل آلدئیدی با دی هیدروکسی استون فسفات است که این واکنش ها به کمک آنزیم آلدولاز کاتالیز می شوند . نتیجة آن اتصال دی هیدروکسی استون فسفات به یک آلدئید است. واکنش شمارة 6 همچنین برعکس واکنش شمارة 4، راه گلیکولیز است. واکنش های شمارة 7 و 10 واکنش های هیدرولیز فسفات هستند که از هر کدام از این واکنش ها، یک مولکول فسفات معدنی Pi تولید می شود و این واکنش به ترتیب توسط آنزیم هایی به نامهای فروکتوز بیس فسفات از یا FBPase و سدوهپتولوز بیس فسفات از یا sbpASE کاتالیز می شوند. باقیماندة واکنش های چرخة کلوین توسط آنزیم هایی کاتالیز می شوند که در آن پنتوز فسفات نیز همین واکنش ها ار کاتالیز می نمایند. در واکنش های شمارة 8 و 11 که هر دو توسط آنزیم ترانس ستولاز کاتالیز می شوند، یک واحد دو کربنة ستونی از یک قتند ستوزی به مولکول گلیسرآلدئید –3- فسفات منتقل می گردد و در نتیجه یک قند 5 کربنة ستوزی به نام گزیلولوز –5- فسفات یا Xu5P تولید می شود. در نتیجة انجام این واکنش ها فرآورده های دیگری نیز تولید می شوند که عبارتند از قند 4 کربنة آلدوزی به نام اریتروز –4- فسفات یا E4P که از واکنش شمارة 8 و ریبوز –5- فسفات یا R5P که از واکنش شمارة 11 به دست می آیند. قند اریتروز –4-فسفات یا E4P تولیدی در واکنش شمارة 8 به عنوان یکی از دو واکنش گر، وارد واکنش شماره 9 می شود. مولکول های گزیلولوز –5- فسفات یا Xu5P تولیدی در واکنش های شمارة 8 و 11 به کمک آنزیم فسفوپنتوزاپیمراز در واکنش شمارة 12 به ریبولوز –5- فسفات یا Ru5p تبدیل می شود. ریبوز –5- فسفات یا R5P به دست آمده از واکنش شمارة11 نیز به نوبة خود توسط آنزیم ریبوز فسفات ایزومراز در واکنش شمارة 13 به Ru5P تبدیل می شود و در نتیجه چرخة کلوین تکمیل می گیردد. از 11 آنزیمی که در چرخه کلوین فعال هستند، تنها سه آنزیم در بافت های حیوانی وجود ندارند که عبارتند از فسفوریبولوکیناز، ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز و سدوهپتولوز بیس فسفاتاز یا SBPase .
یکی از مهمترین آنزیم های جهان که واکنش تثبیت گازکربنیک را کاتالیز می نماید، ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز یا RuBP carboxylase است، زیرا تقریباً تمامی حیات روی کرة زمین بستگی به فعالیت آن دارد. این پروتئین احتمالاً به علت پایین بودن راندمان کاتالیزوری بستگی به فعالیت آن دارد. این پروتئین احتمالاً به علت پایین بودن راندمان کاتالیزوری (Kcat تقریباً برابر )، حدود 50 درصد پروتئین های برگ را تشکیل می دهد، بنابراین فراوان ترین نوع پروتئین در عالم حیات است . آنزیم ریبولوز بیش فسفات کربوکسیلاز در گیاهان عالی و اغلب موجودات ذره بینی فتوسنتزی از 8 زیر واحد بزرگ (L) (477 باقیماندة اسیدهای آمینة در برگهای توتون) رمز گشایی شده توسط DNA کلروپلاست و 8 زیر واحد کوچک (S) (123 باقیماندة اسید آمینه) رمزگشایی شده توسط ژن موجود در هسته، تشکیل شده است و این آنزیم را با نشان می دهند. مطالعات اشعة X که از این آنزیم توسط کارل-ایواربراندن و دیوید ایزنبرگ انجام گرفته است، نشان می دهد که آنزیم تقارن یک منشور مکعبی را دارد. زیر واحد بزرگ آنزیم از یک زنجیر پلی پپتیدی با ساختمان غالب بتا و یک ساختمان فنری شکل حاوی جایگاه فعال آنزیم، تشکیل شده است (شکل شماره 220). وظیفة زیر واحد کوچک آنزیم هنوز مشخص نشده است.
راهکار پذیرفته شدة نحوة عمل آنزیم RuBP کربوکسیلاز که در حد وسیعی توسط خود کلوین مشخص شده بود در شکل شمارة221 نشان داده شده است. در اولین واکنش آنزیم، یک پروتون از کربن شمارة3 ریبولوز بیس فسفات جذب می کند. این واکنش که محدود کنندة سرعت عمل آنزیم است مولکول اندیولات تولید می کند که این مولکول در حملة هسته دوستی به مولکول گازکربنیک شرکت می کند. در نتیجة این واکنش، ملکول بتاستواسید به دست می آید که بالافاصله از کربن شمارة4 مورد حملة آب قرار می گیرد و به یک ترکیب 6 کربنه حد واسط تبدیل شده که این ترکیب به دو مولکول سه کربنه شکسته می شود . محصول نهایی این فرایند دو مولکول 3- فسفوگلیسرات یا PG3 است. نیروی محرکة تولید مولکول های PG3 واکنش تجزیه ترکیب حدواسط بتاستواسید می باشد که این واکنش می تواند در شرایط استاندارد و PH فیزیولوژیک (7=Ph) انرژی معادل 1/35 کیلو ژول بر مول تولید نمید.
شکل شمارة220 نشان می دهد که پروتئین دارای ساختمان چهار بعدی است و محورهای چهارتایی آن به طرف بیننده می باشد. همچنین ساختمان یک زیر واحد بزرگ پروتئین را نشان می دهد که در آن دو نوع پروتئین و دو قسمت غالب پروتئین را تشکیل می دهند.
واکنش ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز از طریق تولید یک ترکیب حد واسط اندیولات انجام می گیرد که با شرکت در یک حملة نوکلئوفیلی به گاز کربنیک یک بتا ستواسید تولید می گردد.
آنزیم ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز برای فعالیت، نیاز به یون منیزیم دارد و احتمالاً در پایدار کردن بارهای منفی که در جریان کاتالیز تولید می شوند، شرکت می کند. یون منیزیم همچنین با یک گروه مهم کاتالیزوری به نام گروه کاربتامات (-NH-COO-) پیوند می یابد.
مجموعة واکنش های چرخة کلوین را می توان در معادلة ذیل خلاصه کرد:
محصول اولیة فتوسنتز، یعنی گلیسرآلئید –3- فسفات در راهای متنوع متابولیکی خارج و یا داخل کلروپلاست مورد استفاده قرار می گیرد. به عنوان مثال به کمک آنزیم های دیگر راه کلوین، این مولکول می تواند به فروکتوز –6- فسفات و سپس به کمک آنزیم های فسفوگلوکز ایزومراز و فسفوگلوکومیوتاز به گلوکز –1- فسفات تبدیل شود. گلوکز –1-فسفات، پیش ساخت قندهای دیگر در گیاهان به حساب می آید، که مهمترین این قندها عبارتند از ساکاروز (مهمترین قند حامل برای تحویل کربوهیدرات ها به سلولهای غیرفتوسنتزی)، نشاسته (پلی ساکارید اصلی ذخیرهای گیاه) و سلولز (سازندة ساختمان دیوارة سلولی سلول های گیاهی). با توجه به نوع گیاه و راه متابولیکی، مادة مورد اثر آنزیم یعنی گلوکز –1-فسفات با تشکیل یکی از ترکیبات مانند –GDP,-CDP,-ADP و یا –UDP گلوکز فعال می شود. واحد گلوکز در نهایت به پایانة یک زنجیر پلی ساکاریدی در حال رشد اضافه می گردد.
ب- کنترل چرخة کلوین: گیاهان در طول روشنایی روز، انرژی مورد نیاز خود را از طریق انرژی نوری و انرژی واکنش های فتوسنتز که در پناه نور (تاریکی) انجام می گیرند تأمین می کنند و در طول شب و تاریکی، مانند سایر موجوات زنده، باید از انرژی ذخیره ای خود برای تولید مولکول های پرانرژی مانند ATP و NADPH از طریق راههای متابولیکی گلیکولیز، فسفوریلاسیون اکسیدی و پنتوز فسفات استفاده کنند. به علت اینکه استرومای کلروپلاست حاوی آنزیم های راه گلیکولیز، پنتوز فسفات و همچنین چرخة کلوین است، بنابراین باید یک راهکار کنترل حساس به نور در استروما باشد تا از هدر دادن محصولات فتوسنتز جلوگیری نماید.
مطالعات نشان می دهد که کنترل مواد ورودی به یک راه متابولیکی از طریق تنظیم فعالیت آنزیم مربوط به واکنش هایی انجام می گیرد که از حالت تعادل، بسیار فاصله دارند، یعنی تغییرات انرژی آزاد آنها بسیار منفی است. از جدول شمارة37 می توان چنین استباط کرد که بهترین واکنش هایی که می تواند در کنترل چرخة کلوین دخالت نمایند واکنش های شمارة 2، و 10 از شکل شمارة 219 می باشند که به ترتیب توسط سه آنزیم RuBP کربوکسیلاز، FBPase و SBPase کاتالیز می شوند. در حقیقت راندمان کاتالیزری این سه آنزیم در شرایط موجود زنده از یکدیگر متفاوت می باشد.
فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز بستگی به سه عامل وابسته به نور دارد:
1- PH : در روشنایی به علت پمپ شدن پروتون از استروما به طرف حفرة داخلی تیلاکوئید، PH استروهمای کلروپلاست گیاه تقریباً از 0/7 به 0/8 افزایش می یابد. بهترین PH فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز نزدیک به 8 است.
2- غلظت یون منیزیم: پروتون هایی که در اثر تابش نور به حفرة داخلی تیلاکوئید منتقل می شوند در مقابل باعث حرکت و خروج یون های منیزیم از حفرة داخلی به طرف استروما می گردند. یون های منیزیم خروجی از حفرة داخلی تیلاکوئید در تحریک فعالیت آنزیم ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز دخالت دارند.
3- در بسیاری از گیاهان ترکیبی به نام –2 کربوکسی آرابینیتول –1- فسفات یا CA1P تولید می شود که این ترکیب از فعالیت ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز یا RuBP فقط در تاریکی جلوگیری می کند. (شکل شمارة 222).
آنزیم های FBPase و SBPaseبا افزایش PH و غلظت یون منیزیم و همچنین NADPH می شوند. تأثیر این عوامل توسط یک سیستم کنترل کنندة ثانویه که به پتانسیل اکسیداسیون و احیای استروما پاسخ می دهد، کامل می شود. یک نوع پروتئین با وزن مولکولی 12 کیلودالتون به نام تیوردوکسین که در اغلب انواع سلول ها وجود دارد، حاوی یکگروه دی سولفیدی سیستین(Cystine) می باشد که به وط برگشت پذیری احیا می شود. تیوردوکسین احیاشده، هردو آنزیم FBPase و SBPase را به کمک یک واکنش تعویض دی سولفیدی فعال می سازد (شکل شمارة223). سطح اکسیداسیون و احیای تیوردوکسین توسط دومین آنزیم حاوی دی سولفید به نام فرودکسین- تیوردوکسین رداکتاز ابقا می شود. این آنزیم به طور مستقیم به وضعیت و حالت اکسیداسیون و احیای فرودوکسین محلول پاسخ می دهد. اندازة این پاسخ به میزان روشنای بستگی دارد. سیستم تیوردوکسین همچنین آنزیم فسفوفورکتوکییناز یا PFK را غیرفعال می سازد. این آنزیم مهمترین عامل انجام واکنش های متابولیکی گلیکولیز به حساب می آید. بنابراین در گیاهان، نور باعث تحریک چرخة کلوین می شود ولی از فعالیت گلیکولیز جلوگیری می نماید، در حالی که تاریکی اثر معکوس دارد و به همین علت معروف است که واکنش های فتوسنتزی تاریکی در تاریکی انجام نمی گیرند.
شکل شمارة223- نحوة عمل فعال سازی آنزیم های FBPase و SBPase به کمک نور، فتوسیستم I که در اثر نور فعال شده است فرودوکسین (Fd) محلول را احیا می کند.
شکل شمارة223 نشان می دهد که چگونه فردوکسین احیا شدة آنزیم فرودکسین- تیورودکسین رداکتاز را احیا می سازد و این آنزیم به نوبة خود پیوند دی سولفیدی تیورودکسین را احیا می کند. تیوردوکسین احیا شده به کمک تعویض دی سولفید، یا بیس فسفاتاز غیرفعالی وارد واکنش می شود و در نتیجه این آنزیم کنترل کنندة چرخة کلوین را فعال می سازد.
ج- تنفس نوری: ازسال 1960 میلادی این موضوع شناخته شده بود که گیاهان در روشنایی از طریق یک راه متابولیکی، جدای از فسفوریلاسیون اکسیدی، اکسیژن مصرف می کند و گازکربنیک خارج می سازند. در حقیقت در سطح پایین گازکربنیک و سطح بالای اکسیژن، فرایند تنفس نوری بر تثبیت گازکرینیک از راه فتوسنتز برتری می یابد. اساس و پایة پدپدة تنفس نوری غیر قابل انتظار است: اکسیژن و گازکربنیک به عنوان مواد مورد اثر آنزیم ریبولوز بیس فسفات کربوکسلاز با هم رقابت می کنند، به همین دلیل این آنزیم را همچنین ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز- اکسیژناز یا روبیسکو نیز می نامند. در واکنش اکسیژناز، اکسیژن با ماده مورد اثر دیگر آنزیم، یعنی ریبولوز بیس فسفات ، وارد واکنش می گردد و مولکول های 3- فسفوگلیسرات یا pg3 و 2- فسفوگلیکولات را تولید می کند (شکل شمارة 224). 2- فسفوگلیکولات به کمک آنزیم های مخلتف در پراکسی زوم و میتوکندریون تا حدودی اکسید شده و به گاز کربنیک تبدیل می شود. بنابراین تنفس نوری، قسمتی از کارهای فرآیند فتوسنتز را بی اثر می سازد.
1- تنفس نوری، مولکول های ATP و NADPH را از بین می برد- راه متابولیکی تنفس نوری در شکل شمارة 225 نشان داده شده است . مولکول گلیکولات از کلروپلاست وارد پراکسی زوم یا گلی اکسی زوم می شود و در آنجا به کمک آنزیم گلیکولات اکسیداز اکسیده شده و به گلی اکسیلات و پراکسید هیدروژن تبدیل می گردد. پراکسید هیدروژن عامل اکسید کنندة خطرناکی است که به کمک یک آنزیم حاوی هم به نام کاتالاز به آب و اکسیژن تجزیه می شود. گلی اکسیلات می تواند در یک واکنش انتقال عامل آمین به گلیسین تبدیل شده و وارد میتوکندی گردد. در داخل میتوکندری دو مولکول گلیسین به یک مولکول سرین و یک مولکول گازکربنیک تبدیل می شود. این واکنش منبع تولید گازکربنیک در تنفس نوری به حساب می آید. اسید آمینة سرین مجدداً به داخل پراکسی زوم بر می گردد و در آنجا یک واکنش انتقال عامل آمینی، آن را به هیدروکسی پیرووات تبدیل می کند.
در ادامة راه متابولیکی تنفس نوری هیدروکسی پیرووات، در داخل پراکسی زوم، به کمک آنزیم هیدوکسی پیرووات رداکتاز، احیا شده و به گلیسرات تبدیل می شود. در داخل سیتوزول، گلیسرات فسفوریله شده و به 3-فسفوگلیسرات تبدیل می شود و این ترکیب مجدداً وارد کلروپلاست می گردد و در آنجا توسط چرخة کلوین به مادة اولیه، یعنی ریبولوز بیس فسفات تبدیل می گردد. نتیجة نهایی این چرخة پیچیدة تنفس نوری این است که مقداری از مولکول های پرانرژی ATP و NADPH که توسط واکنش های نوری فتوسنتز تولید شده بودند، بدون اینکه مورد استفاده گیاه قرار بگیرند، از بین می روند.