مطالعه بیان ژنهای کاسپاز3 وbaxدر سلولهای lncap تحت القای کمپلکس vo-salen
چکیده
در این پژوهش کمپلکس معدنیVO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salenاز تراکم آلدولی اتیلن دی آمین سالسیل آلدهید در حضور ترکیب وانادیوم استیل استونات سنتز گردید. ابتدا قدرت آنتیاکسیدانی Salen به وسیلهی آزمون DPPHمورد ارزیابی قرار گرفت، نتایج نشان داد که Salen قدرت آنتیاکسیدانی بسیار ضعیفی در مقایسه با کمپلکسهای وانادیوم اکسید آن دارد. ارزیابی اثرات سمیت سلولی و ضد تکثیری کمپلکسهای Salen، VO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salenنشان داد که رشد سلولهایLNCaP بعد از 16 ساعت تیماربه ترتیب با IC50 برابر با 276/736 ، 42/428 و 55/403 میکرومولار مهار گردید. جهت ارزیابی رویداد مرگ برنامهریزی شدهی سلولی، بیان کمی برخی از ژنهای کد کنندهی فاکتورهای مسیر سیگنالینگ مرتبط با آپوپتوزیس سلولی مورد بررسی قرار گرفت یافتههای حاصل از این آزمایشها نشان داد هر دو کمپلکسVO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salen بیان کاسپاز 3 را به ترتیب به میزان 82/1 و 16/7 برابر القا میکند، القای بیان ژن bak توسط VO-Salenو نیز بیان ژن bax بهوسیلهی 5-Br-meso-VO-Salen ممکن است باعث پلیمریزاسیون پروتیئنهای Baxو Bakدر غشای میتوکندری شده و با بیان کاسپاز3 مسیر میتوکندریایی آپوپتوزیس ادامه یابد.
قسمتی از متن:
مرحله ی نسخه برداری معکوس در RT-PCR
نسخه های mRNA می توانند به طور قابل توجهی ایجاد ساختمان های ثانویه یا دایمر هایی نمایند که توانایی آنزیم نسخه بردار معکوس در تبدیل mRNA به cDNA را تحت تاثیر قرار می دهد. این امر از
دقت روش RT-PCR در تعیین کمیت mRNA های مختلف می کاهد(24).دو آنزیم نسخهبردار معکوس رایج،AMV-RT[1]و [2]MMLV-RT هستند. AMV-RT با دوامتر از MMLV-RT بوده و تا دمای 55 درجهی سانتیگراد پلیمریزاسیون قابل توجهی را حفظ مینمایند(25) و میتواند به رفع مشکل ایجاد ساختمان ثانویهی RNA کمک نماید. در مقابل MMLV-RTو مشتقات ساخته شده از آن توسط مهندسی ژنتیک به طور معنیداری فعالیت RNase H کمتری از AMV-RT دارند. از آنجا که کاهش فعالیت RNaseH میتواند در سنتز محصولات با زنجیره بلند موثر باشد، در صورتی که هدف از آزمایش تکثیر مولکول cDNA با اندازهی کامل باشد، ممکن است MMLV-RT گزینهی بهتری محسوب گردد(26).
مرحلهی نسخهبرداری معکوس را میتوان با استفاده از پرایمرهای اختصاصی یا پرایمرهای الیگو دی تی[3] انجام داد. استفاده از پرایمرهای اختصاصی mRNA ، باعث کاهش تکثیر زمینهای[4] میشود، حال آنکه استفاده از الیگو دی تی تعداد مولکولهای mRNA که میتوانند از یک نمونه کوچک RNA مورد آنالیز قرار گیرند را به حداکثر میرساند. پرایمرها میتوانند باعث انحرافی بارز در تعدادکپی mRNA محاسبه شده شوند(27).
1-1-15-مرحله واکنش زنجیرههای پلیمراز در RT-PCR
رایجترین آنزیم DNA پلیمراز مورد استفاده DNA– پلیمرازTaq[5] است که دارای یک فعالیت نوکلئازی 3´ → 5´ بوده، اما فاقد فعالیت اگزونوکلئازی اصلاح خطا میباشد. از اینرو، هنگامی که صحت
فرایند، هدف اصلی است استفاده از آن توصیه نمیگردد. ثابت میکائیلیس آنزیمهای دیگر میتوانند تا دو برابر متفاوت از Taq پلیمراز باشند که این امر اثری مستقیم بر دمای اتصال[6] موثر پرایمر دارد(27)، اما در هر بار تغییر آنزیم، شرایط آزمایش باید بهینه گردد و نتایج بهدست آمده ممکن است مستقیما قابل مقایسه نباشند.
غلظت های Mg2+ و dNTP نیازمند کنترل دقیق هستند، زیرا Mg2+ فعالیت آنزیم را تحت تاثیر قرار داده و مخلوط های dNTP نا متعادل باعث کاهش صحت عمل پلی مراز می شوند. همچنین Mg2+ باعث افزایش دمای ذوب یا Tm در DNA دو رشته ای شده و تولید کمپلکس هایی محلول با dNTPs می نماید. از این رو غلظت های بالای dNTP ها در فعالیت پلی مراز اختلال نموده و اتصال پرایمر را توسط کاهش Mg2+ آزاد تحت تاثیر قرار می دهد(28).
1-1-16-مفاهیم Real Time PCR
1-1-16-1-خط پایه
چرخه های ابتدایی PCR که طی آن تغییر اندکی در سیگنال فلورسنس ایجاد می گردد ( معمولا چرخه های 3 تا 15 ) را خط پایه[7] می نامند. تغییرات در شرایط واکنش و محیط می تواند میزان فلورسنس تولیدی را تحت تاثیر قرار دهد. به طور کلی سطح فلورسنس در هر چاهک متناسب با میزان مولکول هدف موجود در آن است. سطوح فلورسنس ممکن است به دلیل تغییرات در محیط واکنش که ایجاد یک سیگنال زمینه ای می نماید ، دچار نوساناتی شود. سیگنال زمینه ای به ویژه طی چرخه های ابتدایی PCR و قبل از تجمع معنی دار قطعه هدف مشهود تر است. طی این چرخه های ابتدایی PCR ، سیگنال زمینه ای تمام چاهک ها برای تعیین سطح فلورسنس خط پایه در تمام تیوب های واکنش مورد استفاده قرار می گیرد. در این حالت، هدف تعیین زمانی است که تکثیر قطعه مورد نظر به طور معنی داری بیش از سیگنال زمینه ای شود. که این امر اندازه گیری دقیقتر فلورسنس را تسهیل می نماید(29).
1-1-16-2-چرخه آستانه[8]
در Real Time PCR واکنش ها توسط یک نقطه زمانی ( یا یک سیکل PCR ) مشخص میگردد که در آن تکثیر قطعه هدف برای نخستین بار قابل تشخیص میگردد. این معیار معمولا چرخه آستانه یا ( CT ) نامیده میشود و زمانی است که شدت فلورسنس تولیدی در اثر تکثیر قطعات طی واکنش زنجیره ای پلیمراز تا سطحی بالاتر از میزان نسبتا ثابت فلورسنس زمینه ای افزایش مییابد. ملاک تعیین آستانه معمولا 10 برابر انحراف استاندارد Rn برای چرخه های اولیه PCR ( خط پایه ) است. آستانه باید در ناحیه ای قرار گیرد که PCR به صورت نمایی تکثیر می یابد. آستانه یک میزان عددی است که به هر واکنش نسبت داده شده و نشان دهنده یک نقطه از نظر آماری معنی دار در بالاتر از خط پایه محاسبه شده می باشد. برای بدست آوردن مقادیر صحیح CT لازم است که خط پایه دو چرخه قبل از میزان CT برای فراوان ترین نمونه قرار گیرد. به دامنه غلظت های آغاز کننده نمونه که منجر به مقادیر صحیح CT میگردد، دامنه دینامیکی گفته می شود(30).
فهرست مطالب
عنوان……………………………………………………………………… صفحه
فصل اول: مقدمه و تاریخچه
1-مقدمه. 2
1 -1- سرطان. 2
1-1-1- ویژگی های اساسی سلول های سرطانی. 3
1-1-2-عاملهای سرطان. 3
1-1-3-ژنتیک سرطان. 4
1-1-3-3- ژنهای مهار کنندهی تومور 7
1-1-5- بررسی سرطان پروستات از دیدگاه ژنتیکی. 8
1-1-6- مرگ سلولی آپوپتوزیس... 9
1-1-6-1- مسیر آپوپتوزیس... 10
1-1-6-2- مسیر خارج سلولی آپوپتوزیس... 11
1-1-6-2- مسیر داخل سلولی آپوپتوزیس... 12
1-1-6-3- تنظیم مسیر داخلی آپوپتوزیس از طریق پروتئینهای خانواده Bcl2. 13
1-1-7-ماشین آپوپتوتیک.. 15
1-1-7-1-کاسپازها و مسیرهای آپوپتوتیک.. 16
1-1-7-1-1-ساختار کاسپازها و فعالیت آنزیماتیک.. 16
1-1-7-1-2-ساختار پروکاسپازها 16
1-1-7-1-3- ساختارهای کاسپازهای فعال. 17
1-1-7-1-4-کاسپازهای عمل کننده 18
1-1-8-کمپلکسهای سالن. 19
1-1-8-1-کمپلکسهای نوع سالن. 20
1-1-8-1-1-جنبههای عمومی کمپلکسهای سالن. 20
1-1-8-1-2-کمپلکسهای قابل حل در آب سالن. 21
1-1-8-1-3-کمپلکس آهن سالن. 21
1-1-9- Real Time PCR.. 22
1-1-10-مقایسه ی Real Time PCR و PCR معمولی. 22
1-1-11 -فازهای PCR.. 23
1-1-12-اصول RT-PCR به شیوهی معمولی و Real Time. 24
1-1-13- Real Time PCR یک مرحلهای یا دو مرحلهای. 24
1-1-14-مرحله ی نسخه برداری معکوس در RT-PCR.. 25
1-1-15-مرحله واکنش زنجیرههای پلیمراز در RT-PCR.. 26
1-1-16-مفاهیم Real Time PCR.. 27
1-1-16-1-خط پایه. 27
1-1-16-2-چرخه آستانه. 27
1-1-16-3-منحنیهای استاندارد 28
1-1-17-تئوری Real Time PCR.. 29
1-1-17-1- روشهای مختلف تعیین کمیت به وسیلهی Real Time PCR.. 30
1-1-17-1-1-تعیین کمیت مطلق. 30
1-1-17-1-2-روش منحنی استاندارد برای تعیین کمیت نسبی. 30
1-1-17-2-منحنی ذوب و پرایمر دایمرها 30
1-1-17-2-1-پرایمر دایمرها 31
1-1-17-2-2-اثر پرایمر دایمرها بر PCR کمی. 32
1-1-18-رنگهای متصل شونده به DNA.. 32
1-2- پیشینهی تحقیق. 33
فصل دوم: مواد و روشها
2ـ مواد و روشها 42
2ـ1ـ ابزار مورد استفاده 42
2ـ2ـ رده سلولی. 42
2ـ3ـ مواد مورد استفاده 42
2ـ3ـ1ـ بافر PBS. 42
2ـ3ـ2ـ محیط کشت RPMI 1640. 43
2ـ3ـ3ـ آنتی بیوتیک.. 43
2ـ3ـ4ـ محیط کشت فریزینگ.. 43
2ـ3ـ5ـ محلولMTT. 43
2ـ3ـ6ـ بافر گلایسین. 44
2ـ3ـ7ـ محلول استوک EDTA (5/0 مولار) 44
2ـ3ـ8ـ بافر X5 TAE (Tris- Acetic acid-EDTA) 44
2-3-9- بافر بارگذاری. 44
2-3-10- پرایمرهای مورد استفاده 45
2-3-11-کیت Real Time PCR SYBR GeenI 45
2-3-12- سنتز کمپلکس VOS و 5BMVOS. 45
2-3-12-1- سنتز لیگاند شیف‌باز H2L1: 46
2-3-12-2- سنتز کمپلکسVOL1: 46
2-3-12-3- سنتز لیگاند H2L2 46
2-3-12-4- سنتز کمپلکس VOL2 : 47
2-3-13- سایر مواد 47
2-4- روشها 48
2-4-1- تعویض محیط کشت.. 48
2-4-2- کشت مجدد سلولها 48
2-4-3- ذخیره و نگهداری بلند مدت سلولها 49
2-4-4- حیات مجدد سلولها 51
2-4-5- شمارش سلولها با تریپان بلو 51
2-4-6- سنجش حیات سلولها با آزمون MTT. 52
2-4-7-استخراج RNA.. 52
2-4-8- الکتروفورز RNA بر روی ژل آگاروز 54
2-4-9-روشهای آشکار سازی RNA.. 54
2-4-10-RT-PCR.. 55
2-4-11- واکنش Real Time PCR.. 56
2-6-3- اجزای تشکیل دهندهی واکنش در Real Time PCR.. 56
2-7- روش مورد استفاده برای تعیین کمیت 57
فصل 3 نتایج
3- نتایج. 59
3-1- بررسی اثر آنتی اکسیدانی salen. 59
3-2بررسی اثرات سیتوتوکسیسیتی و ضد تکثیری salen، VOS و 5BMVOS بر روی لاینهای سلولی LNCaP 60
3-2-1 بررسی کسر ماندگاری سلولها با استفاده از آزمون MTT. 60
3-2-1-1-نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیرVOS بر روی لاینهای سلولی LNCaP. 60
3-2-1-2مطالعات مورفولوژیکی سلولهای تیمار شده با VOS استفاده از تصویربرداری با میکروسکوپ اینورت 61
3-2-2- 1- نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیر Salen بر روی لاینهای سلولی LNCaP. 62
3-2-2- 2- مطالعات مورفولوژیکی سلولهای تیمار شده با Salen 63
3-2-3-1- نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیر 5BMVOS بر روی لاینهای سلولی LNCaP. 64
3-2-3-2- مطالعات مورفولوژیکی سلولهای تیمار شده با 5BMVOS. 65
3-3- نتایج حاصل از استخراج و بارگذاری RNA بر روی ژل آگارز 66
3-4- نتایج حاصل از Real Time PCR.. 68
3-4-1بررسی منحنی ذوب مربوط به ژن GAPDH به عنوان ژن خانهدار، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تیمار 68
3-4-2- منحنی استاندارد ژن GAPDH ، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تیمار: 70
3-4-3- منحنی تکثیر ژنها 71
3-4-3منحنی تکثیر ژنهای ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR از تیمار با VOS 71
3-4-4منحنی تکثیر ژنهای ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR قبل و بعد از تیمار با 5BMVOS. 72
3-4-5- نتایج حاصل از آنالیز دادهها با استفاده از روش2-ΔΔCt 74
3-5- نتایج حاصل از بارگذاری PCR بر روی ژل آگارز 2 درصد. 75
3-5-1-نمونههای تیمار شده با VOS. 75
3-5-2-نمونههای تیمار شده با 5BMVOS. 75
3-6- اثر مهاری DMSO , Salen و VOS بر روی آنزیم Taq DNA پلیمراز 76
فصل 4 : بحث و نتیجهگیری
4- بحث.. ……….........78
منابع………….……………………………………………………………..83