مطالعه بیان ژنهای کاسپاز3 وbaxدر سلولهای lncap تحت القای کمپلکس vo-salen

مطالعه بیان ژنهای کاسپاز3 وbaxدر سلولهای lncap تحت القای کمپلکس vo-salen

چکیده­

در این پژوهش کمپلکس معدنیVO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salenاز تراکم آلدولی اتیلن دی آمین سالسیل آلدهید در حضور ترکیب وانادیوم استیل استونات سنتز گردید. ابتدا قدرت آنتی­اکسیدانی Salen به وسیله­ی آزمون DPPHمورد ارزیابی قرار گرفت، نتایج نشان داد که Salen قدرت آنتی­اکسیدانی بسیار ضعیفی در مقایسه با کمپلکس­های وانادیوم اکسید آن دارد. ارزیابی اثرات سمیت سلولی و ضد تکثیری کمپلکس­های Salen، VO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salenنشان داد که رشد سلول­هایLNCaP بعد از 16 ساعت تیماربه ترتیب با IC₅₀ برابر با 276/736 ، 42/428 و 55/403 میکرومولار مهار گردید. جهت ارزیابی رویداد مرگ برنامه­ریزی شده­ی سلولی، بیان کمی برخی از ژن­های کد کننده­ی فاکتورهای مسیر سیگنالینگ مرتبط با آپوپتوزیس سلولی مورد بررسی قرار گرفت یافته­های حاصل از این آزمایش­ها نشان داد هر دو کمپلکسVO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salen بیان کاسپاز 3 را به ترتیب به میزان 82/1 و 16/7 برابر القا می­کند، القای بیان ژن bak توسط VO-Salenو نیز بیان ژن bax به­وسیله­ی 5-Br-meso-VO-Salen ممکن است باعث پلیمریزاسیون پروتیئن­های Baxو Bakدر غشای میتوکندری شده و با بیان کاسپاز3 مسیر میتوکندریایی آپوپتوزیس ادامه یابد.

قسمتی از متن:

مرحله ی نسخه برداری معکوس در RT-PCR

نسخه های mRNA می توانند به طور قابل توجهی ایجاد ساختمان های ثانویه یا دایمر هایی نمایند که توانایی آنزیم نسخه بردار معکوس در تبدیل mRNA به cDNA را تحت تاثیر قرار می دهد. این امر از

دقت روش RT-PCR در تعیین کمیت mRNA های مختلف می کاهد(24).دو آنزیم نسخه­بردار معکوس رایج،AMV-RT[1]و [2]MMLV-RT هستند. AMV-RT با دوام­تر از MMLV-RT بوده و تا دمای 55 درجه­ی سانتیگراد پلیمریزاسیون قابل توجهی را حفظ می­نمایند(25) و می­تواند به رفع مشکل ایجاد ساختمان ثانویه­ی RNA کمک نماید. در مقابل MMLV-RTو مشتقات ساخته شده از آن توسط مهندسی ژنتیک به طور معنی­داری فعالیت RNase H کمتری از AMV-RT دارند. از آنجا که کاهش فعالیت RNaseH می­تواند در سنتز محصولات با زنجیره بلند موثر باشد، در صورتی که هدف از آزمایش تکثیر مولکول cDNA با اندازه­ی کامل باشد، ممکن است MMLV-RT گزینه­ی بهتری محسوب گردد(26).

مرحله­ی نسخه­برداری معکوس را می­توان با استفاده از پرایمر­های اختصاصی یا پرایمرهای الیگو دی تی[3] انجام داد. استفاده از پرایمرهای اختصاصی mRNA ، باعث کاهش تکثیر زمینه­ای[4] می­شود، حال آن­که استفاده از الیگو دی تی تعداد مولکول­های mRNA که می­توانند از یک نمونه کوچک RNA مورد آنالیز قرار گیرند را به حداکثر می­رساند. پرایمرها می­توانند باعث انحرافی بارز در تعدادکپی mRNA محاسبه شده شوند(27).

1-1-15-مرحله واکنش زنجیره­های پلیمراز در RT-PCR

رایج­ترین آنزیم DNA پلیمراز مورد استفاده DNA– پلیمرازTaq[5] است که دارای یک فعالیت نوکلئازی 3^´ → 5^´ بوده، اما فاقد فعالیت اگزونوکلئازی اصلاح خطا می­باشد. از این­رو، هنگامی که صحت

فرایند، هدف اصلی است استفاده از آن توصیه نمی­گردد. ثابت میکائیلیس آنزیم­های دیگر می­توانند تا دو برابر متفاوت از Taq پلیمراز باشند که این امر اثری مستقیم بر دمای اتصال[6] موثر پرایمر دارد(27)، اما در هر بار تغییر آنزیم، شرایط آزمایش باید بهینه گردد و نتایج به­دست آمده ممکن است مستقیما قابل مقایسه نباشند.

غلظت های Mg²⁺ و dNTP نیازمند کنترل دقیق هستند، زیرا Mg²⁺ فعالیت آنزیم را تحت تاثیر قرار داده و مخلوط های dNTP نا متعادل باعث کاهش صحت عمل پلی مراز می شوند. همچنین Mg²⁺ باعث افزایش دمای ذوب یا Tm در DNA دو رشته ای شده و تولید کمپلکس هایی محلول با dNTPs می نماید. از این رو غلظت های بالای dNTP ها در فعالیت پلی مراز اختلال نموده و اتصال پرایمر را توسط کاهش Mg²⁺ آزاد تحت تاثیر قرار می دهد(28).

1-1-16-مفاهیم Real Time PCR

1-1-16-1-خط پایه

چرخه های ابتدایی PCR که طی آن تغییر اندکی در سیگنال فلورسنس ایجاد می گردد ( معمولا چرخه های 3 تا 15 ) را خط پایه[7] می نامند. تغییرات در شرایط واکنش و محیط می تواند میزان فلورسنس تولیدی را تحت تاثیر قرار دهد. به طور کلی سطح فلورسنس در هر چاهک متناسب با میزان مولکول هدف موجود در آن است. سطوح فلورسنس ممکن است به دلیل تغییرات در محیط واکنش که ایجاد یک سیگنال زمینه ای می نماید ، دچار نوساناتی شود. سیگنال زمینه ای به ویژه طی چرخه های ابتدایی PCR و قبل از تجمع معنی دار قطعه هدف مشهود تر است. طی این چرخه های ابتدایی PCR ، سیگنال زمینه ای تمام چاهک ها برای تعیین سطح فلورسنس خط پایه در تمام تیوب های واکنش مورد استفاده قرار می گیرد. در این حالت، هدف تعیین زمانی است که تکثیر قطعه مورد نظر به طور معنی داری بیش از سیگنال زمینه ای شود. که این امر اندازه گیری دقیقتر فلورسنس را تسهیل می نماید(29).

1-1-16-2-چرخه آستانه[8]

در Real Time PCR واکنش ها توسط یک نقطه زمانی ( یا یک سیکل PCR ) مشخص می­گردد که در آن تکثیر قطعه هدف برای نخستین بار قابل تشخیص می­گردد. این معیار معمولا چرخه آستانه یا ( C_T ) نامیده می­شود و زمانی است که شدت فلورسنس تولیدی در اثر تکثیر قطعات طی واکنش زنجیره ای پلیمراز تا سطحی بالاتر از میزان نسبتا ثابت فلورسنس زمینه ای افزایش می­یابد. ملاک تعیین آستانه معمولا 10 برابر انحراف استاندارد Rn برای چرخه های اولیه PCR ( خط پایه ) است. آستانه باید در ناحیه ای قرار گیرد که PCR به صورت نمایی تکثیر می یابد. آستانه یک میزان عددی است که به هر واکنش نسبت داده شده و نشان دهنده یک نقطه از نظر آماری معنی دار در بالاتر از خط پایه محاسبه شده می باشد. برای بدست آوردن مقادیر صحیح C­_T لازم است که خط پایه دو چرخه قبل از میزان C_T­ برای فراوان ترین نمونه قرار گیرد. به دامنه غلظت های آغاز کننده نمونه که منجر به مقادیر صحیح C_T می­گردد، دامنه دینامیکی گفته می شود(30).

---

فهرست مطالب

عنوان……………………………………………………………………… صفحه

فصل اول: مقدمه و تاریخچه

1-مقدمه. 2

1 -1- سرطان. 2

1-1-1- ویژگی های اساسی سلول های سرطانی. 3

1-1-2-عامل­های سرطان. 3

1-1-3-ژنتیک سرطان. 4

1-1-3-3- ژن­های مهار کننده­ی تومور 7

1-1-5- بررسی سرطان پروستات از دیدگاه ژنتیکی. 8

1-1-6- مرگ سلولی آپوپتوزیس... 9

1-1-6-1- مسیر آپوپتوزیس... 10

1-1-6-2- مسیر خارج سلولی آپوپتوزیس... 11

1-1-6-2- مسیر داخل سلولی آپوپتوزیس... 12

1-1-6-3- تنظیم مسیر داخلی آپوپتوزیس از طریق پروتئین­های خانواده Bcl2. 13

1-1-7-ماشین آپوپتوتیک.. 15

1-1-7-1-کاسپازها و مسیرهای آپوپتوتیک.. 16

1-1-7-1-1-ساختار کاسپازها و فعالیت آنزیماتیک.. 16

1-1-7-1-2-ساختار پروکاسپازها 16

1-1-7-1-3- ساختارهای کاسپازهای فعال. 17

1-1-7-1-4-کاسپازهای عمل کننده 18

1-1-8-کمپلکس­های سالن. 19

1-1-8-1-کمپلکس­های نوع سالن. 20

1-1-8-1-1-جنبه­های عمومی کمپلکس­های سالن. 20

1-1-8-1-2-کمپلکس­های قابل حل در آب سالن. 21

1-1-8-1-3-کمپلکس آهن سالن. 21

1-1-9- Real Time PCR.. 22

1-1-10-مقایسه ی Real Time PCR و PCR معمولی. 22

1-1-11 -فازهای PCR.. 23

1-1-12-اصول RT-PCR به شیوه­ی معمولی و Real Time. 24

1-1-13- Real Time PCR یک مرحله­ای یا دو مرحله­ای. 24

1-1-14-مرحله ی نسخه برداری معکوس در RT-PCR.. 25

1-1-15-مرحله واکنش زنجیره­های پلیمراز در RT-PCR.. 26

1-1-16-مفاهیم Real Time PCR.. 27

1-1-16-1-خط پایه. 27

1-1-16-2-چرخه آستانه. 27

1-1-16-3-منحنی­های استاندارد 28

1-1-17-تئوری Real Time PCR.. 29

1-1-17-1- روش­های مختلف تعیین کمیت به وسیله­ی Real Time PCR.. 30

1-1-17-1-1-تعیین کمیت مطلق. 30

1-1-17-1-2-روش منحنی استاندارد برای تعیین کمیت نسبی. 30

1-1-17-2-منحنی ذوب و پرایمر دایمرها 30

1-1-17-2-1-پرایمر دایمرها 31

1-1-17-2-2-اثر پرایمر دایمرها بر PCR کمی. 32

1-1-18-رنگ­های متصل شونده به DNA.. 32

1-2- پیشینه­ی تحقیق. 33

فصل دوم: مواد و روش­ها

2ـ مواد و روش‌ها 42

2ـ1ـ ابزار مورد استفاده 42

2ـ2ـ رده سلولی. 42

2ـ3ـ مواد مورد استفاده 42

2ـ3ـ1ـ بافر PBS. 42

2ـ3ـ2ـ محیط کشت RPMI 1640. 43

2ـ3ـ3ـ آنتی بیوتیک.. 43

2ـ3ـ4ـ محیط کشت فریزینگ.. 43

2ـ3ـ5ـ محلولMTT. 43

2ـ3ـ6ـ بافر گلایسین. 44

2ـ3ـ7ـ محلول استوک EDTA (5/0 مولار) 44

2ـ3ـ8ـ بافر X5 TAE (Tris- Acetic acid-EDTA) 44

2-3-9- بافر بارگذاری. 44

2-3-10- پرایمرهای مورد استفاده 45

2-3-11-کیت Real Time PCR SYBR GeenI 45

2-3-12- سنتز کمپلکس VOS و 5BMVOS. 45

2-3-12-1- سنتز لیگاند شیف‌باز H₂L¹: 46

2-3-12-2- سنتز کمپلکسVOL¹: 46

2-3-12-3- سنتز لیگاند H₂L² 46

2-3-12-4- سنتز کمپلکس VOL² : 47

2-3-13- سایر مواد 47

2-4- روش­ها 48

2-4-1- تعویض محیط کشت.. 48

2-4-2- کشت مجدد سلول­ها 48

2-4-3- ذخیره و نگه­داری بلند مدت سلول­ها 49

2-4-4- حیات مجدد سلول­ها 51

2-4-5- شمارش سلول­ها با تریپان بلو 51

2-4-6- سنجش حیات سلول­ها با آزمون MTT. 52

2-4-7-استخراج RNA.. 52

2-4-8- الکتروفورز RNA بر روی ژل آگاروز 54

2-4-9-روش­های آشکار سازی RNA.. 54

2-4-10-RT-PCR.. 55

2-4-11- واکنش Real Time PCR.. 56

2-6-3- اجزای تشکیل دهنده­ی واکنش در Real Time PCR.. 56

2-7- روش مورد استفاده برای تعیین کمیت 57

فصل 3 نتایج

3- نتایج. 59

3-1- بررسی اثر آنتی اکسیدانی salen. 59

3-2بررسی اثرات سیتوتوکسیسیتی و ضد تکثیری salen، VOS و 5BMVOS بر روی لاین­های سلولی LNCaP 60

3-2-1 بررسی کسر ماندگاری سلول­ها با استفاده از آزمون MTT. 60

3-2-1-1-نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیرVOS بر روی لاین­های سلولی LNCaP. 60

3-2-1-2مطالعات مورفولوژیکی سلول­های تیمار شده با VOS استفاده از تصویربرداری با میکروسکوپ اینورت 61

3-2-2- 1- نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیر Salen بر روی لاین­های سلولی LNCaP. 62

3-2-2- 2- مطالعات مورفولوژیکی سلول­های تیمار شده با Salen 63

3-2-3-1- نتایج حاصل از آزمون MTT توسط تاثیر 5BMVOS بر روی لاین­های سلولی LNCaP. 64

3-2-3-2- مطالعات مورفولوژیکی سلول­های تیمار شده با 5BMVOS. 65

3-3- نتایج حاصل از استخراج و بارگذاری RNA بر روی ژل آگارز 66

3-4- نتایج حاصل از Real Time PCR.. 68

3-4-1بررسی منحنی ذوب مربوط به ژن GAPDH به عنوان ژن خانه­دار، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تیمار 68

3-4-2- منحنی استاندارد ژن GAPDH ، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تیمار: 70

3-4-3- منحنی تکثیر ژن­ها 71

3-4-3منحنی تکثیر ژن­های ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR از تیمار با VOS 71

3-4-4منحنی تکثیر ژن­های ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR قبل و بعد از تیمار با 5BMVOS. 72

3-4-5- نتایج حاصل از آنالیز داده­ها با استفاده از روش2^-ΔΔCt 74

3-5- نتایج حاصل از بارگذاری PCR بر روی ژل آگارز 2 درصد. 75

3-5-1-نمونه­های تیمار شده با VOS. 75

3-5-2-نمونه­های تیمار شده با 5BMVOS. 75

3-6- اثر مهاری DMSO , Salen و VOS بر روی آنزیم Taq DNA پلیمراز 76

فصل 4 : بحث و نتیجه­گیری

4- بحث.. ……….........78

منابع………….……………………………………………………………..83

خرید فایل